肉类掺假检测鉴定技术的研究进展

　　摘要从近年来, 肉类掺假的事件层出不穷, 使得消费者对肉类的食品安全问题甚为担忧。从物理技术、化学技术、免疫学技术、电泳技术以及DNA鉴定技术等方面对目前肉类掺假检测的国内外研究进展作一综述, 并对肉类掺假检测技术的研究趋势进行展望。

　　关键词肉类掺假; 物理技术; 电泳技术; DNA聚合酶链反应; DNA条形码

　　从近年来屡次曝光的羊肉掺假，到2013年欧洲的“马肉丑闻”，再到2014年国内沃尔玛的“驴肉掺假门”，各种肉类掺假的事件层出不穷，使得百姓们对肉类的食品安全问题甚为担忧。要杜绝“掺

　　假肉”上餐桌，光靠末端检查是不能从根上解决问题的，最关键的还是要不断完善法律法规，加强监管和执法手段，对危害食品安全的行为狠狠打击。现今，我国对这些“掺假肉”的制作加工没有任何标准可循，它一直被归纳到“餐饮行业”的管理范围内。随着食药总局的成立，食品安全分段监管将成为历史，但肉的真假仍然没有任何法律追溯。要想打击“掺假肉”的泛滥问题，首先要制定统一的检测方法，执法人员和检测机构才能有依据去辨别市场上的真假肉，因此尽快研究出台肉类的鉴别检测方法刻不容缓。

　　一直以来，研究人员都在致力于开发出一种简单、灵敏、快速并且低成的分析方法来检测鉴定肉和肉产品的种类和品质。到目前为止，这些方法的开发是基于肉类的解剖学和组织学特征，蛋白质的检测特异性及其相关技术，如电泳法，等电点法（IEF）和酶联免疫吸附剂测定法（ELISA）等。然而，这些方法并不是通用的方法，仅适用于特定情况。并且，这些方法是昂贵、耗时、复杂，缺乏特异性，只适用于对新鲜肉类。而免疫学的方法，尤其是酶联免疫吸附剂测定法和侧流免疫测定法，由于其专一性、简单性且灵敏度高，在过去的一段时间内被普遍采用来测定肉类的种类；然而，由于肉蛋白质在加热后会发生热变性，因此这些免疫学的方法在检测经过高温的肉制品时并不能得到令人满意的结果。目前，由于DNA的高温稳定性和高度守恒的性质，DNA分析法已广泛用于肉类的品种鉴定。最初，检测研究人员使用DNA杂交法测定肉的种类，但由于DNA杂交法操作复杂和耗时长，现在正被在DNA聚合酶链反应（PCR）检测法所替代。DNA分析法是准确、快速、低成的，并在所有情况下普遍适用。分别从物理技术、化学技术、免疫学技术、电泳技术、以及DNA技术等角度，对国内肉类掺假检测鉴定技术的研究进展进行了综述，为进一步的研究工作及标准制定提供一定的参考。

　　物理检测方法主要是通过辨别每个物种畜体的解剖差异，如肌肉和脂肪的外观、颜色、气味、质地和味道等为肉类的品种和品质鉴定提供一个初步的判断。现今有大量的物理方法可以针对肉类结构的不同关键信息进行检测，通过对检测结果的比对可以对肉类的品种和品质进行鉴定，特别是适合用来评估肉的品质。物理鉴别的方法由于操作简便，比较适用于现场执法工作，表1将这些不同类型的物理方法进行了汇总并针对其主要的优点和缺点进行了评估。

　　表1 肉类的物理检测方法汇总及其主要的优缺点

　　根据不同物种肉类之间的差异性，化学测试可以很容易地检测出肉类的品种。例如，由于牛肉和水牛肉中的胡萝卜素含量不同，可依此来执行 印度的防止牛屠宰法（见表2）。此外，由于马肉中的糖原含量大于其他的肉类，可通过化学检测来鉴定肉的品种。但由于糖原在屠宰后会消失，并且动物的肝脏中也存在一定量的糖原，当混合在香肠中时会干扰测定结果[10]。因此，可以结合表2中的数据，将马肉的糖原测定应结合亚油酸的含量、脂肪中的碘含量以及脂肪的折射率的测定结果进行综合判断。

　　表2 不同的肉类品种中不同的化合物的含量

　　血清学的和电泳的方法已被确认是可以区分原料肉的种类的方法。电泳方法专注于分离和染色特定的蛋白质，但由于蛋白质的变性，难以分析经过热处理的肉类样品。电泳是一种强大的用于分离蛋白质的研究技术，其分离的蛋白质通常作为分离凝胶中可视的特异蛋白带，必要时，可以通过简单的非特异性染色、酶学方法或免疫学方法。分离是取决于同质凝胶、浓度梯度凝胶、pH梯度凝胶或变性剂的使用。用于物种识别的有效应用方法包括基于原料肉的水提取物中有色的肌红蛋白带的等电势或在特定的可视化后适当的种专一性的同功酶之间的区别。电泳数据的解释会受到酶蛋白色层图的视觉复杂度的影响。

　　SDS-PAGE被广泛使用，用于分离蛋白亚基和测定其分子量。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成SDS-多肽复合物，由于SDS-多肽复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度进入聚丙烯酰胺凝胶，其移动速度取决于多肽的分子量。SDS-PAGE可用来在肉的混合物或商业香肠中识别肉的种类，也可以用来识别熟的鱼的种类。这项技术使得研究人员能够识别以下的肌纤维和肌质肌肉蛋白质：肌球蛋白和肌动蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白辅肌动蛋白。

　　等电点聚焦就是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚焦于与其等电点相当的pH位置上。

　　使用IEF PAGE从加热后的牛肉和猪肉的混合物中发现含有10%的猪肉。通过 等电点聚焦肉的混合物可以成功得到蛋白质表达谱，从而通过多元数据分析来区分牛肉和猪肉。然而，当肉被同一物种但是更为廉价的材料所替代时，难以通过等电点聚焦来区分肉的不同品质。好处则是评估样是不依赖于个体成分的特定知识，所以这种分析方法在任何标准实验室中都相对容易实现。

　　基于非常特殊的抗原抗体间的相互作用， 免疫试验可以检出并确定复杂混合物如食品提取物中特定的分析[20]。现今，最常用的2个免疫学技术为琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID，agar gel immune-diffusion）和最新的酶联免疫吸附试验（ELISA，enzyme linkedimmuno-sorbent assay）。

　　AGID采用了一个双扩散技术，是将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，两者各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两者相遇即发生待异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。通过AGID可以用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体），可鉴定抗原性物质或免疫血清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点。1977年Hayden就通过开展AGID在熟牛肉香肠中检测出1%，3%和5%的鸡肉。虽然AGID已被公众所认可，并广泛应用于肉类的检测，但是却存在着局限性。因为该法无法检测近缘物种，并且获取结果的时间太长，从采样到收到结果需要约96 h。

　　ELISA是几种不进行沉淀程序的定性的免疫学技术之一，将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。ELISA测试快速，并且对于低到2%的掺假识别高度敏感。ELISA一直用来定性和定量的研究生物体液和组织样品中的多种抗原和抗体。

　　通过识别同源物种蛋白质来鉴别肉类品种的ELISA方法有3个：形间接ELISA、 双抗体夹心（DAS，doubleantibody sandwich） ELISA和竞争ELISA。

　　该技术首先用特异性抗原包被固相载体，加入待测的抗体，使之与包被在固相载体上的抗原结合，再加入酶标记的第二抗体，使之与待测抗体结合；反应后再加入底物显色，颜色的深浅与标中待测抗体的量成正比。当用于测定含有约3%掺假的肉类物种时，间接ELISA是一个完善的基础系统。

　　DAS-ELISA的原理是将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。DAS-ELISA已被改良其特异性和灵敏度，可用来检测含约0.5%掺假的肉类。

　　竞争ELISA形式，这种形式涉及到肉类提取物预培养技术的应用（试验抗原与已知数量的特异性抗体在PBST中培养）到抗原涂层板。在这种检测技术中，抗原或抗体中的一个被标记上检测分子，如放射标记125I、HRP、AP或荧光分子等。由于待测物中存在与相应抗原或抗体相同的竞争性分子，因而标记后的检测分子可以被竞争性地洗脱，从而信号值相应降低，达到检测的目的。

　　DNA杂交技术通常用于识别肉的物种。杂交的双方是所使用的探针和待检的核酸。检测对象可以是克隆化的基因组DNA，也可以是细胞总DNA或总RNA。探针必须经过标记，以便示踪和检测。使用最普遍的探针标记物是同位素， 但由于同位素的安全性，近年来发展了许多非同位素标记探针的方法，例如，使用荧光分子。核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异性，可以用来鉴定熟肉的物种，但是对于近缘物种并不能很好地分辨。Ebbehoj等通过增加来自交叉杂交物种的未标记DNA改进了DNA杂交技术来减少交叉反应。他们区分绵羊和山羊，约有10%的检测极限。

　　PCR是一种生物体外的酶促合成特定DNA序列的方法。用于鉴别肉类的物种，PCR将线粒体DNA作为检测的目标基因。选用线粒体DNA而不是基因组DNA作为肉类物种鉴定的目的基因是由于线粒体是从母体遗传的，通常一个个体上只存在一个等位基因，因此不会产生由不止一个等位基因而导致的序列歧义的情况。线粒体基因的变量区域在每个细胞中都存在着成千上万的副，这就增加了阳性结果的出现概率，即使是在由于剧烈的加工条件而使得DNA严重破碎的情况下也是如此。

　　由于PCR可以将特定的DNA序列，甚至单个细胞样品中的单拷贝序列呈指数期的复制成多个副，因此PCR技术拥有高度的选择性和灵敏度。PCR可以用于鉴定肉类品种的定性试验。通过PCR可以鉴定近缘物种，甚至可以区别产自同一物种不同性别牲畜的生肉。

　　RAPD-PCR（the random amplified polymorphicDNA-PCR）也称作AP-PCR（arbitrary primer PCR）是一种用任意的随机引物来检测DNA序列图谱的检测方法。由RAPD-PCR得出的特殊且特定的模型可以用来区分肉类的物种。RAPD-PCR不仅拥有简单、快速、重现性好、敏感度高、辨识性高等优点，并且可以在单次的PCR反应中同时检测多个物种的DNA。这种分析方法也适用于识别在不同的加工条件下的肉类和肉类产品的物种。

　　使用种特异性PCR（ species-specific PCR）鉴定肉和肉制品的物种比其他的PCR检测方法更加的简便、灵敏和快速。然而，单次PCR反应可检测的物种数量却被降低。这种PCR方法可以通过检测目标DNA或线粒体DNA来鉴定肉的种类。猪的特异性DNA引物已被成功用来鉴定各种肉和肉产品，如生肉、熟肉、香肠、腌肉产品和汉堡包等[32]。种特异性PCR方法由于其操作简单、高特异性和高灵敏度，是一个强大的牛肉鉴定手段，在加工和未加工的食物中皆适用。

　　线粒体DNA的12S rRNA，16S rRNA，d循环（D-loop）和细胞色素b区域（cytochrome b regions）

　　一般被用作目标物种鉴别的目标区域。通过使用设计在细胞色素b基因上的引物，种特异性PCR已成功应用于检测和区分食品中的鸡、火鸡、猪、牛和羊的成分。

　　PCR-RFLP技术（the restriction fragment lengthpolymorphis），即限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术，其基原理是用PCR扩增目的DNA，扩增产物再用特异性内切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝胶电泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位点分布不同，产生不同长度的DNA片段条带。此项技术大大提高了目的DNA的含量和相对特异性，而且方法简便，分型时间短。但这种技术较为复杂的，并需要相配的实验室，严格的分析技术和昂贵的酶。然而，这种分析方法针对熟肉的鉴定有着较大的潜能。有试验证明，PCR-RFLP可在肉类混合物中，鉴定出不到1%的水平的鸡和火鸡肉。同样，羊肉和山羊肉也可通过使用ApaI限制酶的PCR-RFLP分析来区分。

　　针对线粒体DNA使用PCR-RFLP技术，可以鉴别经过卤水、热处理和发酵的近缘的肉制品，包括猪、牛、野猪、野牛、绵羊、山羊、马、鸡、火鸡和野味等。然而，绝大多数的RFLP方法是适合用来定性检测单一物种的肉，而混合物会产生复杂的指纹，并不容易解读。

　　复合PCR技术（multiplex PCR）采用多对引物对目标基因与线粒体DNA进行测定，可以同步、准确和快速的在单次PCR反应中识别多个肉类品种。已有文献表明，复合PCR可以用来识别鸡肉、火鸡肉、牛肉、猪肉、羊肉、羊肉、驴肉和马肉，其对熟肉和加工肉类的检出限为1%。Dalmasso使用设定在线粒体12s rRNA基因的正向引物和特异性反向引物鉴定鹅、土番鸭、鸡、的火鸡和猪。

　　另有试验使用设定在5S rRNA基因正向引物和 特异性反向引物鉴定出混合在鹅肝中的鸭肝。

　　常规的PCR技术虽然可以对不同物种的混合肉类进行定性检测，但却不能实现对产品中的物种进行定量。而Real-Time PCR（又称实时定量荧光PCR）不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。

　　有研究证实，通过对放大的线粒体12S rRNA基因、细胞色素b基因及16S rRNA基因进行Real-TimePCR试验可以鉴别混合肉中肉的成分。而设计后的探针可以定量的分析马肉、驴肉和猪肉的混合物，并且不局限于食物是否经过加工和现今实验人员可以通过对DNA进行测序来鉴定已知序列的肉类物种。经过实验人员的不断测序分析，现今已有大量的常见动物物种、品种和基因变异的基因序列存于数据库中，如美国国家生物技术信息中心的数据库等。

　　只要物种拥有独特的DNA序列，DNA测序都可以对其进行鉴定，就算是没有任何参考资料的未知样品也同样可以进行鉴定。试验方法为先通过PCR扩增来得到样品的DNA序列，然后将其与数据库中的大量已知物种信息进行比对，就可以得到样品的物种。通过PCR扩增来识别 DNA序列是一种非常直接和有效的方式，通常会伴随着凝胶电泳，并使用 Real-Time PCR对其结果进行定量分析。传统的Sanger测序技术是通过双脱氧链终止法对PCR反应完成时产物的长度进行的末端分析，得出模板链的碱基序列。然而由于Sanger测序法操作繁琐、成较高，不能满足大规模测序的需要。新一代的测序方法则以高通量、低成为主要特点，主要包括Illumina公司的Solexa测序技术、罗氏公司的454测序技术和ABI公司的SOLiD测序技术等，目前已广泛应用于生命科学研究的各个领域。

　　2003年，加拿大Guelph大学的生物学家Paul Hebert教授首次提出利用线粒体细胞色素C氧化酶1（cytochromeC oxidase 1）基因构建物种鉴别体系，而这段拥有648个碱基对的基因序列则被称为DNA条形码（通常被简称作CO1或COI），并期待像在零售业的发展过程中起到了举足轻重作用的条形码技术一样，根据对1个统一的目标基因DNA序列的分析来完成物种鉴定的过程。

　　截止2011年已有112547种动物和近43 000植物、真菌和其他类型生物的DNA条形码已存入数据库中，并且这个数字还在不断增加。DNA条形码作为对地球上现有物种进行识别和鉴定的一项新技术， 受到国内外广泛关注。

　　在美国，为规范鱼类交易，避免以次充好，美国食品和药物管理局2011年年底宣布它将扩大其使用DNA检测在检查海鲜制造商和餐馆。

　　现阶段可用于确定 肉类品种的方法大致可以分为5种： 物理技术、化学技术、免疫学技术、电泳技术、以及DNA鉴定技术。这些检测方法是基于肉类品种之间的解剖差异、化学分析、蛋白质或DNA鉴定而建立的。

　　物理和化学技术适合用于鉴定较为完整的生肉，并可以通过物理方法按照相应的标准对肉类的品质进行分级，并由于其操作简便，较为适用于现场执法工作。而碎肉、肉末以及仅经过适度加工的肉则适合采用免疫学和电泳方法，如SDS-PAGE、IEF和ELISA。

　　但是对于经过热加工的肉类而言，由于热加工会使肉类的蛋白质变性，因此基于DNA的检测方法拥有着更高的可靠性，如传统的DNA分析和实时PCR等。线粒体和基因组中的DNA均可以通过单拷贝和重复序列的方法PCR扩增序列，具体方法的选择会极大程度的受到检测极限的影响。如果需要定量的鉴定肉的种类，则需要选用基于实时PCR分析方法。最新的DNA条形码技术正受到国内外广泛关注，目前已越来越多的在肉类物种的鉴定和执法工作中采用。